論文分享：只用燒杯、酒精燈、進口水浴鍋制備DNA折紙結構
DNA origami（DNA折紙技術）在分子生物學領域越來越被重視，DNA以其獨特的納米尺度、分子線性結構、物理化學穩定性、力學剛性、自我識別能力以及自組裝等優勢，正逐步被應用于分子生物學和電子學等領域，也不斷成為研究熱點。比如在醫藥領域，DNA納米結構作為藥物載體不僅能減少病毒細胞的耐藥性，增強藥物對耐藥病毒細胞的殺傷作用。并且由于載體的存在，藥物在動物體內的循環時間也明顯延長，有利于降低給藥劑量和減輕毒副作用。
很多材料和器件在納米尺度范圍內具有全新的物理性能，當前生命科學的前沿亦必定是納米或分子水平上的研究，“DNA折紙技術”的發展，是生命科學領域發展的必經之途。
DNA折紙技術是什么？
DNA脫氧核糖核酸是生物體的生命遺傳信息的儲存物質。DNA即多個脫氧核苷酸的聚合物，每個核苷酸又由一個脫氧核糖(戊糖)、一個磷酸和一個含氮堿基三部分組成。不同的核苷酸區別在于堿基，有兩類堿基：嘌呤類包括腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，嘧啶類包括胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。核苷酸之間靠磷酸二酯鍵連接，即一個核苷酸的5’磷酸基和另一個核苷酸的3’羥基形成共價鍵，且該鍵是有方向的。兩條DNA單鏈靠堿基對之間的氫鍵能夠反向結合在一起形成雙鏈，配對的原則是：一條鏈的A(或T)與另一條鏈的T(或A)配對，中間含有兩個氫鍵;一條鏈的C(或G)與另一條鏈的G(或C)配對，中間含3個氫鍵。在熱力學驅動下，兩條互補的單鏈DNA分子自發雜交，在雜家的過程中，DNA雙鏈通過氫鍵、范德華力和靜電力互相作用，嚴格遵守Watson-Crick堿基互補配對原則。
2006年，Rothemund首次提出了一種全新的DNA自組裝方法——DNA折紙技術，利用DNA分子的特殊結構和堿基互補配對規則，將天然DNA長鏈的特定區域進行折疊，并用短鏈加以固定，構造出預期的結構。隨著研究的不斷進行，DNA折紙術結構的尺寸和穩定性得到了明顯的改善，DNA折紙術得到的納米結構可以作為單分子反應的平臺，也可作為功能納米粒子、生物分子、量子點組裝的模板。
對于甚多分子生物研究人員來說，DNA origami 結構是研究中必不可少的試驗對象。但是現有技術下DNA Origami 的制備非常昂貴，費時而且還處于小作坊制造階段，產量小，無法大規模制作。制作DNA Origami需要PCR儀，市場上的PCR儀最便宜的兩三萬，國外大牌子的五萬到十萬不等，如果不是實驗室經費充足，未必會有條件進行相關的研究。
為此，對于DNA origami制備方法的研究在國內外一直在進行。今日沉匯儀器要分享的文章就是Low-cost, simple, andscalable self-assembly of DNA origami nanostructures，本文19年5月在 NanoResearch 上發表，主要講介紹如何用實驗室簡單的設備：燒杯、酒精燈、進口水浴鍋制備DNA折紙結構。
常規制備DNA折紙結構方法
ExperimentalSection
Molecular self-assembly with scaffolded DNA origami:Structures were designed with the aid of caDNAnov.02. DNA scaffold of strands of 7560 and 8064 bases derived from the genome of bacteriophage M13 were prepared as described previously. Stapleoligonucleotide strands were prepared by solid-phase chemical synthesis (Eurofins MWG Ebersberg.Germany,HPSF grade). Production of the 42-helix bundle,the six-helix bundle, the Rothemund rectangle and the hexagon-like brick was accomplished in one-pot reaction mixtures.The reaction mixtures contained scaffold strands at a concentration of 50 nm and oligonucleotide strands at 200 nm each.The buffer (pH 8) that was used included Tris (5 mM) EDTA (1 mM).MgCl2 (20 mm) ,and NaCl (5 mm,1x FoB20).The reaction mixtures were subjected to a thermal annealing ramp with use of TETRAD (MJ Research, now Biorad) thermal cycling devices. If not otherwise noted the reaction mixtures were first incubated at 65℃ for 15 min and then cooiled from. 60 to44℃ in steps of 1℃h-1.The reaction products werestored protected from light at 25℃。
傳統方法中使用PCR儀，不用人工精細控制試驗需要的最佳溫度和時間，只需要放入機器中，設定好程序解螺旋，退火等就好。
但是有其他研究人員發現，在某個恒定溫度下也能高概率的制備出DNA Origami結構，并不需要特別精細的控溫和控制時間。在此思路下Low-cost, simple, and scalable self-assembly of DNAorigami nanostructures的作者進行延伸，研究出使用燒杯、酒精燈、水浴鍋制備DNA折紙結構的方法。
同時由于不使用PCR儀器，反應容器也不用局限于96微孔板，直接使用500ML的燒瓶，在這篇文章中作者提供了兩個制作思路。
a幾乎不控制溫度
將樣品放在酒精燈上加熱，之后放在一邊，緩慢自然降溫。這種方法可能只使用對比較robust的結構有用
b較多控制溫度
利用可控溫的水浴鍋，在加熱之后樣品后將其放入溫度恒定的水浴鍋中持續退火，然后再進行冷卻。
具體試驗方法如下：自然退火法
1、mixing up to 25 ml of folding solution with 5 mM Tris，5 mM NaCl, 1 mM EDTA. 20 mM MgCI2，20 40nM of the ssDNA scaffold strand, and 100 nM of each staple strand in a 50mLglass flask.
混合所有原料
2、The flask was heated on a hot plate until solution the solution reached 65-70℃ and held at that temperature for 15 min
加熱至65-70度，恒溫15min
3、With 20 mL of solution in a 50 mL flask in a covered Styrofoam cooler packed with Styrofoam pellets,cooling from 65℃ to room temperature took less than 60 min
在泡沫箱里冷卻至室溫，整個過程大約持續60min
Notice：The flask was vented occasionally approximately every 3-4 min. to relieve pressure build-upas the flask was cooling
注意時不時要給燒瓶放壓
水浴法
1、mixing up to 75mL of folding solution with 5 mM Trnis,5 mM NaCl.1 mM EDTA,20 mM MgCl 2，2040nM of the ssDNAscaffold strand. and 100 nM
of each staplestrand ina 50 ml glass flask
混合所有原料
2、The flask containing the reaction was again heated on hot plate until solution is 65-70℃ and held in this range for 15 min.
將所有混合的原料混合后在加熱板上加熱至65-70，并保持恒溫15min
3、flask as placed in waterbath pre-heated to the desired temperature, for 1-4h.
之后將加熱的溶液放入恒溫水浴鍋中，設置好預定的溫度，保持水浴1-4小時。（在水浴過程中需防止水分蒸干)
（沉匯儀器水浴鍋系列）
4、冰浴10分鐘
干鍋法:
The butane burner asturned on and the height of the ring stand and the gas fiow of the burer was adjusted to reach the desired temperatures (65 70℃ for melting phase and 51-56℃ for annealing
恒溫過程改為調整火焰大小和放置燒杯的鐵架合距離火焰的高度來達到所需溫度。
實驗結果顯示，這兩種方法下，擴大體系對DNA折疊結構形成沒有影響。
但是從實驗結果上來看，這一方法對于制備并沒有技術性突破，由于不再使用PCR儀，加熱，退火等步驟需要靠人監控來判斷合適的時間，這將大大增加人工負擔。雖然大規模反應容器的采用能提高產出規模，但是DNA表征還是需要靠瓊脂糖凝膠電泳來實現。這個設備并不比PCR儀便宜。能用的起瓊脂糖凝膠電泳的實驗室也是買的起PCR儀的，對于這些實驗室來講，這種拋棄省力的PCR儀器，采用耗時的人工，無疑是反裘負薪，買櫝還珠了。
當然這也為今后大規模，便捷，低廉的發展做出了很好的嘗試，為試驗人員開辟了新的思路。
本文由上海沉匯儀器原創，歡迎收藏我們的網站，帶你一起了解科學儀器。
同時關注我們的公眾號，第一時間了解我們的最新資訊和原創科普，購買產品還享受超高折扣哦。
精彩推薦
》》》盤點口罩生產需要的儀器：進口恒溫恒濕箱、超凈工作臺、生物安全柜
》》》新冠疫苗滅活病毒、PCR核酸檢測所需恒溫水槽，加熱水/油浴鍋介紹
|
|
